生物实验室系列--细胞生物学实验技术(二版)

  自《细胞生物学实验技术》（第一版）问世以来，已5年过去了。我们见证了细胞生物学领域又有诸多的重要进展，譬如端粒与端粒酶的研究、诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）的研究、组学革命（omics revalution）、细胞自噬的深入研究等。正如前一版前言中，我们强调指出学科的发展是与技术方法的创新与改良密不可分的，只有有了更精细的技术方法才能揭示出事物的本质变化的规律、事件之间的相互联系。因此技术方法与学科发展是一对孪生兄弟，是比翼双飞的鸟儿，缺一不能共存、缺一不能远翔。上述所列的一些新进展也是和新技术方法出现分不开的。
  为了跟上学科的发展，适应发展的需要，我们也与时俱进地推出《细胞生物学实验技术》第二版，我们对该版的定位是：适合大多数院校（普通高等学校及医药院校）研究生与本科生学习细胞生物技术方法的需要。因此，该版的特点是：以基础训练为主，同时增加最新而又不难掌握与了解的技术，也就是说我们所遵循的仍是“三基”与“五性”的原则。为此，在本版中除了保留原有大部分内容之外，根据反馈意见增加了作为生物学与医学研究最基本手段的组织学切片及基本染色技术。此外，我们也适时地补充了多种干细胞培养的培养方法、鉴定及运用，其中包括诱导多潜能干细胞和肿瘤干细胞培养、细胞自噬、端粒与端粒酶显示技术、酵母双杂交技术、昆虫杆状病毒表达系统等，这不仅反映了技术方法的时代性，更让使用者能够熟悉这些新的技术方法，以便今后能进行更深入、更高层次的探索。
  此外，由于有时为了证明某一现象可以有多种方法，其中有些是最常用的，或者是最可靠的，或是对于初学者必须掌握而且容易掌握的，有些则是“辅助性的”，或是“佐证性的”，为此本版也尝试采用如同《精编细胞生物学实验指南》（Short Protocals in Cell Biology,ed by J S Bonifacino,et al,by John Wiley & Sons.Inc.）那样将所介绍的方法分为基本方案、备择方案和支持方案3类。基本方案是指总体推荐或是最普遍应用的方法，也是使用者应力求掌握的方法。备择方案乃针对采用不同设备和试剂而达到相同结果时可选用者，或许可以认为它是基本方案的一种补充与佐证。支持方案所描述的是进行基本方案或备择方案所需要的那些附加步骤，这些步骤独立于核心方案，它们或许也可以在其他实验中用到。诚然，这样分类只是强调各种方案在证明一种现象中所起的作用分量有所不同，以及要求学习者必须掌握的程度不一，各个学校可根据具体情况、实验条件灵活选择运用。
  最后，我们十分感谢参加编写的全体新老编委们，是他们的高度责任心与不厌其烦地不断修改才使得第二版以新的面貌问世。我同样感激化学工业出版社生物·医药出版分社的编辑们，是他们的耐心指导与建议，才让我们又一次燃起再版的热情与坚持到底的努力。我们诚望使用者从本书中获益以及对我们的不足与错误之处提出批评。
  章静波2011年夏于北京协和医学院

第一版前言
  技术方法对于科学发展的重要性是不言而喻的。有人将技术方法比喻为机车的车轮，设计再好的机车，没有车轮是不可能行进的。较生动的比喻大概要算将技术方法比作“点石成金”的指头，金子再多也有用完的时候，而这“指头”的魔力则是无穷尽的。我更愿意将技术方法与科研思路比喻为鸟儿的双翼，两者缺一不可到达终极目标。
  细胞生物学学科的发展，同样离不开新的技术方法的建立。只有应用显微镜观察到植物和动物的细胞结构，才有了细胞学说(恩格斯将其列为19世纪“三大发现”之一)的创立；只有有了X射线衍射技术方能揭示出DNA的双螺旋结构模式，并从此开辟了分子细胞生物学的新纪元；只有有了核移植技术，才有克隆动物(或许将来还有克隆人)的问世。由上我们可以得出这样的结论：没有精湛的技术方法，就不能(至少很难)登上科学的殿堂。或许正是认识到这一点，美国冷泉港实验室在取得众多科研成果、培养了大量科技人员之外，也没有忽视出版一批技术方法的书籍，诸如《分子克隆》(Molecular Cloning)、《细胞实验指南》(Cell：A Laboratory Manual)和《抗体》(Antibodies)等。有人评价这些书籍是生命科学研究的“圣经”。
  细胞生物学及相关学科在我国的发展极为迅速。迄今我国有不少世界一流的实验室，也取得了一些世界一流的科研成果，但总体来说，我国细胞生物学的研究与世界最前列还有一定的差距。当然其因素是多种多样的，缘由是复杂的。我们相信，我国科研人员的头脑与国外的同行一样优秀，这些差距可能出于我们的技术设备要差一点，所掌握的技术方法尚不够精良与全面，因此做起科学研究来往往要滞后一些。为了缩小这种与最先进实验室的差距，学习与掌握最基础与最先进的研究技术方法，不能不说是一条重要的途径。编写一部新颖、实用的技术方法指导，不失为适时的一种举措。
  本书的大部分作者曾参与《医学细胞生物学实验指导》的编写，他们既有从事科研工作的经验，又有教学经历，他们在具有丰富的感性认识与理性认识的基础上，从众多的技术方法中精选出部分操作程序介绍给读者。相信这些程序均具有严密性、可重复性、可操作性以及一定的新颖性。因此书中介绍的实验技术无论对于一个初涉细胞生物学研究的新手，还是具有丰富实验室工作经验的科研工作者，都有一定的帮助。
  诚然，细胞生物学作为21世纪最活跃的生物科学学科之一，新理论以及新技术方法不断涌现，本书不能穷尽所有方法，也不一定包含刚刚问世的最新技术，它只能引导读者进入细胞生物学的研究领域，今后更多的理论创建与技术方法的革新便有待于大家的努力了。另外，我们并不固执己见，并不认为我们所提供的操作程序是不可变更的，如果使用者在正确的理论指导下，对我们提供的技术方法做出某些修改，并且证明更行之有效，那么请不吝将您宝贵的意见反馈给我们，以便我们能以适当的方式采纳，使本书所提供的技术方法更加先进，更加完善。
  最后，我们要感谢那些虽不是本书的作者，但提供某些有用信息、数据、图片的人们，他们的无私奉献为本书增色。我们更要感谢化学工业出版社现代生物技术与医药科技出版中心的编辑们，他们为出版《生物实验室系列》图书所表现出的敬业精神，是我们编写《细胞生物学实验技术》的动力之一，与他们的精诚合作是一件颇为愉快的事，是以不能不在此书真诚地写上一笔以记之。
章静波
2006年2月5日

为了跟上学科的发展，适应发展的需要，作者对《细胞生物学实验技术》进行修订更新，推出第二版，新版适合大多数院校(普通高等学校及医药院校)研究生与本科生学习细胞生物学技术的需要。特点在于：
  基础训练为主，同时增加最新而又不难掌握与了解的技术。本版中除了保留原有大部分内容之外，根据反馈意见增加了作为生物学与医学研究最基本手段的组织学切片技术，也不失时宜地补充了多种干细胞培养的培养方法、鉴定及运用，其中包括诱导多潜能干细胞(iPScells)和肿瘤干细胞培养、细胞自噬、端粒与端粒酶显示技术、酵母双杂交技术、昆虫杆状病毒表达系统等。
  本版也尝试采用如同《精编细胞生物学实验指南》(ShodProtocols in CellBiology，edJS Bonifacino，et al，byJohnWiley&Sonslnc．)那样将所介绍的方法分为基本方案、备择方案和支持方案3类。基本方案是指总体推荐或是最普遍应用的方法，也是使用者应力求掌握的方法。备择方案乃针对采用不同设备和试剂而达到相同结果时可选用者，或许可以认为它是基本方案的一种补充与佐证。支持方案所描述的是进行基本方案或备择方案所需要的那些附加步骤，这些步骤独立于核心方案，它们或许也可以在其他实验中用到。
  本书可以作为相关高等院校的本科教材，也可供从事细胞生物学研究工作的人员阅读参考。

第一章显微镜技术1
基本方案1普通显微镜的构造及使用方法1
基本方案2相差显微镜的构造及使用方法6
基本方案3荧光显微镜的构造及使用方法8
基本方案4透射电子显微镜与超薄切片技术11
基本方案5扫描电子显微镜与样品制备15
备择方案1激光扫描共聚焦显微镜的构造及使用方法18
备择方案2激光捕获显微切割技术25
支持方案显微摄影技术27
第二章组织学基本技术30
基本方案1石蜡切片技术30
基本方案2冰冻切片技术32
基本方案3苏木素伊红(hematoxylineosinstain,HE)染色技术33
备择方案1吉姆萨（Giemsa）染色技术35
备择方案2组织学切片的Feulgen染色技术35
备择方案3中性脂肪油红O显示（Oil red O stain）技术37
备择方案4组织切片的碱性磷酸酶染色技术（ALP钙钴法）38
备择方案5组织切片的琥珀酸脱氢酶染色（SDH stain）技术39
备择方案6组织切片的核酸甲苯胺蓝显示技术40
第三章细胞结构与成分的显示技术41
基本方案1细胞中DNA和RNA的显示41
基本方案2细胞中过氧化物酶的显示45
基本方案3细胞中碱性蛋白的显示46
基本方案4一氧化氮合酶的显示47
基本方案5细胞中线粒体的活体染色51
基本方案6细胞中糖类和脂类的显示52
基本方案7酸性磷酸酶的显示54
备择方案1细胞中液泡系的活体染色55
备择方案2培养细胞完整生物膜系统的观察56
备择方案3微丝的染色及形态观察57
支持方案间接免疫荧光技术显示胞质微管59
第四章细胞生理实验62
基本方案1细胞的运动62
基本方案2细胞的吞噬活动63
基本方案3细胞自噬检测方法65
备择方案细胞膜通透性的测定69
第五章细胞培养和分析71
基本方案1细胞的原代培养71
基本方案2培养细胞的形态观察和计数74
基本方案3培养细胞生长曲线的绘制和分裂指数的测定77
基本方案4细胞集落形成实验79
基本方案5器官培养方法80
基本方案6鸡胚尿囊培养法83
备择方案1细胞的传代培养85
备择方案2MTT对细胞生长状况的检测86
备择方案3表皮细胞的培养87
备择方案4骨骼肌细胞的培养89
备择方案5内皮细胞的培养90
备择方案6神经胶质细胞的培养91
备择方案7骨髓间充质干细胞的培养及其体外诱导分化92
支持方案1细胞的冻存与复苏93
支持方案2细胞显微测量技术95
支持方案3细胞培养中支原体污染的检测96
支持方案4放射自显影术及同位素液闪测定100
第六章干细胞培养及诱导分化106
基本方案1人胚胎干细胞传代培养106
基本方案2人胚胎干细胞的诱导分化108
基本方案3肿瘤干细胞的分离纯化113
备择方案诱导多潜能干细胞118
支持方案小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
的分离及饲养层的制备120
第七章细胞周期分析124
基本方案流式细胞仪检测细胞周期124
备择方案1细胞同步化实验126
备择方案2通过分析CDK的活性检测细胞周期127
第八章细胞成分的分离与分析130
基本方案1差速离心法分离细胞和细胞器130
基本方案2密度梯度离心法分离细胞组分132
基本方案3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质134
基本方案4Western印迹技术135
备择方案免疫沉淀法137
支持方案蛋白质的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳138
第九章细胞工程基础技术143
基本方案1细胞融合实验143
基本方案2单克隆抗体的制备146
备择方案1染色体提前凝集标本的制备150
备择方案2显微注射技术（核移植）152
备择方案3DNA转染实验（绿色荧光蛋白）154
支持方案体外受精技术158
第十章细胞凋亡的测定162
基本方案1凋亡细胞的普通光镜观察162
基本方案2凋亡细胞的荧光显微镜观察164
基本方案3凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测——DNA梯状条带(DNA ladder)166
备择方案1凋亡细胞的电镜观察167
备择方案2凋亡细胞的原位末端标记法检测168
备择方案3凋亡细胞的单细胞电泳检测169
备择方案4凋亡细胞的流式细胞法检测171
支持方案磷酸酰丝氨酸外化的流式细胞术分析171
第十一章染色体技术173
基本方案1染色体标本制备173
基本方案2端粒及端粒酶显示技术176
备择方案1染色体显带技术186
备择方案2性染色质的制备191
备择方案3姐妹染色单体交换实验194
备择方案4染色体原位杂交技术195
支持方案染色体实验试剂配制197
第十二章分子细胞生物学技术200
基本方案1DNA提取及检测200
基本方案2RNA提取及检测203
基本方案3Southern印迹技术204
基本方案4Northern印迹技术208
基本方案5RNA干扰技术211
基本方案6酵母双杂交技术215
备择方案1RTPCR220
备择方案2原位PCR技术221
备择方案3荧光定量PCR技术224
备择方案4基因芯片技术226
备择方案5原位缺口平移技术231
备择方案6染色质免疫沉淀法233
备择方案7昆虫杆状病毒表达系统238
备择方案8GST pulldown分析241
参考文献244