哺乳动物细胞重组蛋白工程

基因工程技术诞生早期，重组蛋白生产主要以原核细胞为主，后期逐渐发展起来酵母、昆虫等表达系统，但这些表达系统都由于缺乏人类细胞的翻译后修饰，不适合表达结构复杂的大分子蛋白。因此，哺乳动物细胞表达系统是目前重组蛋白药物生产的重要平台，并且越来越成为重组蛋白的主要表达系统。
近三十年特别是近十年来，科研工作者围绕哺乳动物细胞表达系统重组蛋白表达做了大量卓有成效的工作，克服了哺乳动物细胞重组蛋白表达量低、表达不稳定等问题，重组蛋白的产量和质量都有了大幅度提高，重组抗体表达量已经达到克级水平。
为了适应国内哺乳动物细胞表达重组蛋白的迅猛发展及其教学、科研的需要，在长期的科研中，我们不断积累总结经验并归纳提炼，在阅读大量国内外文献的基础上，编著了这本《哺乳动物细胞重组蛋白工程》。全书共分十二章，主要内容包括哺乳动物细胞、基因工程、载体工程、细胞工程、培养基优化、培养工艺、分离与纯化、分析鉴定及重组蛋白技术产品的研究开发与管理、重组蛋白糖基化修饰与控制及重组抗体高效表达与质量控制等内容。
为了方便读者阅读，本书尽可能减少专业术语，力求做到通俗易懂；为了保证理论和技术的前沿性，第一次出现的专业术语都进行了英文注释，并且书后附有中英文词汇表；为便于读者了解国内外近期的发展动态，每章附有引自国内外不同学者近期的重要文献。
本书可作为生物制药相关专业本科生、研究生及从事生物制药的广大科研工作人员的参考用书。参加本书撰写的人员来自河南省重组药物蛋白表达系统国际合作实验室、新乡医学院从事重组蛋白表达科研一线的科研人员，他们具有多年的哺乳动物细胞重组蛋白表达的科研工作经验，为本书编写投入了大量的精力。另外，化学工业出版社在编辑加工中做了大量细致的工作，在此对他们表示衷心感谢！
写作是一项十分复杂而繁重的工作，尽管每位著者都为本书付出了辛勤劳动，但是由于著者水平有限，书中难免有疏漏和不足，敬请读者提出宝贵意见，以便再版时改正。

2020年3月于新乡医学院 王天云

王天云，博士，教授，博士生导师。新乡医学院“太行学者”特聘教授。河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室及生物创新药物工程技术研究中心主任，中国生物化学与分子生物学会理事，河南省生物化学与分子生物学会理事长，教育部“长江学者”，国家科技进步奖评审专家。主持国家自然科学基金4项，省重大科技专项1项，创新杰出人才项目1项；参与国家“863”课题、国家重大科技专项各1项。获省科技进步二等奖2项、三等奖1项。申请国家发明专利35项，已授权16项。发表研究论文86篇，其中SCI收录53篇，被引1076次。长期从事哺乳动物细胞表达系统的研究，建立了国际水平的哺乳细胞表达系统，包括高效表达载体、细胞系及培养基。已实现技术转移2项，专利转化8项。

《哺乳动物细胞重组蛋白工程》围绕建立哺乳动物细胞高效表达体系所需的关键技术，从哺乳动物细胞、基因工程、载体工程、细胞工程、培养基优化、培养工艺和重组蛋白的分离及纯化、分析鉴定、重组蛋白糖基化修饰与控制、重组抗体高效表达与质量控制以及重组蛋白技术产品的研究开发与管理等方面详细介绍了哺乳动物细胞重组蛋白工程相关的理论和技术。
本书内容反映了近十年来哺乳动物细胞重组蛋白工程领域的最新进展，可作为生物制药相关专业本科生、研究生及从事生物制药的广大科研工作人员的参考用书。

第一章　适合重组蛋白表达的哺乳动物细胞          1
 第一节　CHO细胞表达系统                     3
  一、CHO细胞历史与分类                    3
  二、CHO细胞表达系统的优点                  10
  三、CHO细胞培养                       13
 第二节　HEK293细胞表达系统                   17
  一、HEK293细胞的分类与优点                 17
  二、HEK293细胞培养与鉴定                  19
 第三节　其他哺乳动物细胞                     21
  一、人源化细胞系                       21
  二、非人源化细胞系                      23
 参考文献                             24

第二章　基因工程                    28
 第一节　基因工程简介                       28
  一、基因工程概念                       28
  二、基因工程的发展史                     29
  三、基因工程的应用和基因工程医药的前景            32
 第二节　哺乳动物细胞基因工程                   35
  一、目的基因获取                       36
  二、载体系统                         37
  三、DNA的体外重组                     45
  四、重组DNA的转化                     49
  五、重组DNA的筛选与鉴定                  49
  六、目的基因的表达                      50
 参考文献                             52

第三章　载体工程                    55
 第一节　表达载体元件的优化                    56
  一、启动子                          56
  二、增强子                          66
  三、多聚腺苷酸尾                       67
  四、内含子                          67
  五、内部核糖体进入位点和F2A                 68
  六、选择标记                         69
  七、翻译与分泌优化                      69
 第二节　染色质调控元件                      71
  一、核基质附着区                       72
  二、遍在染色质开放元件                    75
  三、绝缘子                          75
  四、稳定抗阻遏元件                      76
 第三节　靶基因整合                        77
  一、位点特异性重组系统                    77
  二、基于核酸酶和DNA修复途径的位点特异性整合        79
 第四节　非靶向转基因整合                     80
  一、转座子                          80
  二、慢病毒载体                        80
 参考文献                             81

第四章　转染与筛选                   87
 第一节　细胞转染                         87
  一、细胞转染的原理                      87
  二、细胞转染方法                       88
 第二节　细胞转染后的筛选                     93
  一、瞬时转染与稳定转染                    93
  二、稳定细胞系的筛选                     94
  三、CHO细胞加压筛选                     99
  四、HEK293细胞表达系统                   102
 参考文献                             106

第五章　基因组编辑与细胞工程              108
 第一节　基因组编辑技术                      109
  一、概念                           109
  二、常用的基因组编辑技术                   109
 第二节　CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中的应用         117
  一、基因的破坏                        119
  二、位点特异性基因整合                    120
  三、基因激活或抑制                      120
  四、基因组水平目的基因敲除的筛选               121
  五、基因编辑应用实验设计                   121
  六、脱靶分析                         124
 第三节　CHO细胞工程                      125
  一、目的基因                         126
  二、细胞工程常用技术                     131
  三、抗凋亡工程                        134
  四、代谢工程调控                       135
  五、细胞骨架与细胞周期工程                  136
  六、蛋白质翻译后修饰工程                   136
  七、蛋白质合成工程                      138
 参考文献                             139

第六章　动物细胞培养基及其优化             144
 第一节　细胞培养基                        145
  一、细胞培养基简介                      145
  二、动物细胞培养基的分类                   146
  三、细胞培养基的相关政策与标准                151
  四、细胞培养基的主要成分                   162
  五、细胞培养基的理化性质                   170
  六、细胞培养基的灭菌及储存                  171
  七、细胞培养基的配制                     173
 第二节　CHO细胞培养基                     177
  一、CHO细胞培养基概况                   177
  二、CHO细胞无血清培养基的成分组成及优化          179
 第三节　其他细胞系培养基                     182
  一、HEK293细胞系培养基                   182
  二、HeLa细胞系培养基                    183
 参考文献                             184

第七章　培养工艺与大规模培养              188
 第一节　动物细胞大规模培养参数                  189
  一、温度                           189
  二、通气                           189
  三、pH                           190
  四、渗透压                          190
  五、搅拌                           190
  六、防止污染                         190
 第二节　动物细胞大规模培养                    191
  一、动物细胞大规模培养反应器                 191
  二、动物细胞大规模培养操作方式                194
 参考文献                             231

第八章　哺乳动物细胞重组蛋白的分离及纯化        234
 第一节　重组蛋白样品的预处理                   234
  一、透析法                          235
  二、超滤法                          235
  三、冷冻干燥法                        236
  四、双水相萃取法                       236
 第二节　重组蛋白分离纯化的原理及方法               237
  一、蛋白质沉淀                        237
  二、亲和色谱                         242
  三、高效液相色谱                       247
  四、分子筛色谱                        254
  五、离子交换色谱                       256
  六、其他纯化技术                       267
 参考文献                             269

第九章　重组蛋白分析与鉴定               271
 第一节　重组蛋白理化性质分析                   272
  一、重组蛋白的电荷异质性分析                 272
  二、重组蛋白分子量测定                    275
  三、重组蛋白的其他性质                    277
 第二节　重组蛋白定量分析技术                   278
  一、标准定量法                        279
  二、比色分析法                        280
  三、紫外吸收法                        282
  四、ELISA测定                       282
  五、蛋白质印迹法                       283
 第三节　空间结构分析                       283
  一、蛋白质的空间结构                     284
  二、X射线衍射晶体分析                    285
  三、核磁共振                         287
  四、生物质谱技术                       290
 参考文献                             292

第十章　重组蛋白糖基化修饰与控制            295
 第一节　糖基化修饰类型及其作用                  295
  一、糖基化及其修饰类型                    295
  二、糖基化修饰的生物学作用                  297
 第二节　重组蛋白糖基化工程及其应用                299
  一、重组蛋白糖基化工程                    299
  二、重组蛋白糖基化修饰改造策略                299
  三、重组蛋白糖基化工程的应用                 301
 第三节　重组蛋白糖基化控制                    302
  一、基因组学水平                       302
  二、系统生物学水平                      305
  三、质量控制与评价                      306
 参考文献                             308

第十一章　重组抗体质量控制               311
 第一节　重组抗体生产细胞的质量控制                312
  一、建构工程细胞和细胞库                   312
  二、细胞质控                         313
 第二节　重组抗体的质控标准物质                  313
  一、理化对照品的结构验证                   313
  二、活性标准品的协作标定                   314
 第三节　重组抗体生产产品的质量控制                315
  一、产品质量一致性分析                    315
  二、生物学活性测定                      317
  三、蛋白质含量及纯度测定                   318
  四、残留杂质分析                       319
  五、安全性和其他检测项目                   319
 第四节　重组抗体生产实例——质量属性评价             319
  一、还原型毛细管凝胶电泳测定重组抗体的纯度及杂质       319
  二、分子排阻高效液相色谱测定重组抗体的纯度及杂质       319
  三、分子排阻色谱分离静态光散射测定聚体的分子量        320
  四、成像毛细管等电聚焦电泳检测电荷异质性           320
  五、圆二色谱分析抗体分子的结构                320
 参考文献                             321

第十二章　重组蛋白药物的研究开发与管理         322
 第一节　重组蛋白药物研究开发的一般过程              322
  一、上游研究                         323
  二、中试研究                         324
  三、临床前研究                        326
  四、临床研究                         328
  五、新药临床研究与生产的申报和审批              330
 第二节　重组蛋白药物研究开发的相关法规              333
  一、重组蛋白技术产品研究开发相关法规的主要内容        333
  二、研发各个环节的质量管理规范                337
 第三节　重组蛋白技术产品的生物安全问题              339
  一、重组蛋白技术产品及其产品生物安全问题的范围        340
  二、重组蛋白技术产品及其产品生物安全问题的预防和控制     341
  三、生物安全性评价                      342
 参考文献                             344

附录　中英文词汇表                   347