秸秆共接种厌氧发酵技术

厌氧发酵技术是秸秆资源化的重要途径，工程化应用能够直接获得沼气、沼渣、沼肥，在好氧条件下木质素成分进一步降解还可以获得高附加值产品。但在现行秸秆沼气工程中，各成分的水解仍是该过程的主要瓶颈。常见的接种物由于缺乏合适的环境选择压力，无法形成高效菌群，造成体系发酵效率不高。反应器中功能菌群强化秸秆发酵机制的研究不多，长期运行“失稳”及产甲烷活性下降的微生物学特征有待揭示。另外，未经处理的畜禽粪便直接还田存在危害，对农业生产造成安全隐患。所以利用秸秆和畜禽粪便共发酵制备有机肥，对于缓解我国生态环境压力具有重要意义。
本书通过添加厌氧污泥到瘤胃菌系中构建、驯化共接种菌群，分别在批次和半连续条件下研究厌氧发酵特性及其微生物学机制。具体如下：将瘤胃菌群和厌氧污泥按不同比例共接种，评价不同体系稻秸的发酵特性；利用MiSeq测序技术揭示固液相功能菌群特征，分析特定菌属和发酵参数之间的相关性。应用共接种物，评价不同秸秆产甲烷及各成分降解等发酵特性，明确共接种物在秸秆产甲烷潜力测试方面的应用价值。半连续条件下，逐步提高有机负荷（OLR）驯化共接种菌群，借助菌群结构分析以及GH5基因的相对q-PCR技术，描述菌群类型和数量的变化，明确功能菌群的形成在水解和产甲烷活性提高中的作用。设置不同OLR和回流比考察共接种发酵特性，分析不同工况下功能菌群的特征；借助绝对q-PCR技术，明确嗜氢型甲烷菌在功能菌群形成中的作用。通过金属形态分级提取技术，描述沼渣金属形态分布的变化，分析金属可利用性与产甲烷活性之间的关系，最终解析体系“酸败”的微生物机制。设置高含固率和物种比（F/I）不同组合，考察两者对产甲烷活性及稻秸降解率的影响，明确嗜氢型产甲烷辅酶F420与甲烷产率显著性相关，可以用来表征产甲烷活性。在高固态半连续条件下，考察稻秸发酵特性，确定了三维荧光光谱-平行因子分析技术（EEM-PARAFAC）监控产甲烷活性的有效性，揭示嗜氢型甲烷菌在秸秆厌氧发酵中的重要作用。
本书应用共接种技术提高了秸秆发酵效率，通过多维分析手段揭示了厌氧代谢过程中的微生物学机制，能为秸秆沼气工程参数设定和工艺运行提供参考。
本书的研究要感谢本人的博士导师江南大学阮文权教授、黄振兴副教授，在整个研究思路的确定、实验的开展等方方面面给予的指导和支持。阮老师渊博的学识及宽阔的胸怀，总能给人以鼓励和帮助；黄老师思维敏捷，工作扎实使我受益匪浅。还要特别感谢安徽建筑大学李卫华老师团队在Matlab软件应用、样品平行因子分析等方面的指导和帮助。
本研究得到了国家自然科学基金项目——共培养菌群强化木质纤维素厌氧消化及其形成机制研究（51678279），常州市科技支撑计划项目（农业）——基于氢传递策略强化农作物秸秆发酵及功能菌剂制备研究（CE20182015）的经费资助，也得到了江苏高校“青蓝工程”及江苏省高职院校教师专业带头人高端研修项目资助，在此一并表示感谢。

邓玉营
2020年6月

邓玉营，常州工程职业技术学院，副教授。
2013年以来的科研实践中，基于厌氧协同机理，提出共培养策略，选择环境压力，构建了高效功能菌群，实现农业废弃物的高效生物转化；借助于分子生态学，微量元素形态分布以及三维荧光光谱-平行因子分析技术等多种手段，建立反应装置运行的监控指标体系，实现了厌氧消化工程的高效运行，并阐明工程化实践中“酸败”，“氨氮抑制”现象的微生物学机制，对强化农业废弃物厌氧消化具有理论和实际价值，丰富了沼气工程微生物机制的内涵。
主要参与了国家自然基金面上项目“共培养菌群强化木质纤维素厌氧消化及其形成机制研究”（5167879）的研究工作。以此研究为基础，分别在《应用与环境生物学报》《农业机械学报》《农业工程学报》《环境农业科学学报》《International Biodeterioration & Biodegradation》及《Applied Microbiology and Biotechnology》以第 一作者公开发表核心、EI及SCI论文8篇。在机理研究的基础上，积极解决本行业技术难题，完成的“园林绿化废弃物高效厌氧消化菌剂的制备研究”，立足于实际问题，提出解决方法。

厌氧发酵技术是农作物秸秆资源化的重要途径，能够获得沼气、沼渣、沼肥及高附加值产品等，还可以与畜禽粪便共发酵制备有机肥，对缓解我国生态环境压力、优化能源比例等方面具有重要意义。但水解仍是该过程的主要瓶颈，常见的接种物无法获得高效菌群，导致体系发酵效率不高。
《秸秆共接种厌氧发酵技术》介绍通过瘤胃内含物和厌氧污泥共接种技术，驯化获得稳定高效接种物，分别在批次和半连续条件下描述厌氧发酵特性，从微生物菌群、功能基因转录、辅酶等多维水平上表征共接种功能微生物协同机制；明确了嗜氢型产甲烷活性在秸秆厌氧发酵中的重要作用。本书可以作为环境工程专业人员开展相关研究的参考，也可以为秸秆资源化从业人员提供工程实践帮助。

1绪论/001
1.1厌氧菌群类型 /002
1.1.1水解菌群/002
1.1.2互营氧化菌群/008
1.1.3乙酸互营氧化菌群/010
1.2发酵工艺类型 /011
1.2.1两相发酵工艺/011
1.2.2共发酵工艺/012
1.2.3高固态发酵工艺/013
1.3工艺参数调控 /014
1.3.1有机负荷/014
1.3.2接种比和物种比/014
1.3.3温度/015
1.4指标监控体系 /015
1.4.1产甲烷值/015
1.4.2固渣微观结构分析/016
1.4.3水解酶活指标/017
1.4.4沼液指标分析/017
1.4.5菌群的分子生物学诊断/021

2不同共接种比稻秸厌氧发酵及固液相菌群特性/023
2.1材料与方法 /024
2.1.1接种物与秸秆原料/024
2.1.2实验设计/024
2.1.3指标分析/025
2.1.4MiSeq 16S基因测序/026
2.1.5统计分析/026
2.2结果与讨论 /027
2.2.1产甲烷特性/027
2.2.2稻秸降解和水解酶活性/029
2.2.3VFAs浓度和pH的变化/032
2.2.4固液相中微生物菌群结构特征/034
2.2.5共接种体系菌群与发酵参数相关性分析/038
2.3本章小结 /041

3不同秸秆共接种厌氧发酵特征/043
3.1材料与方法 /044
3.1.1接种物与秸秆原料/044
3.1.2实验设计/044
3.1.3指标分析/045
3.1.4产甲烷动力学分析/045
3.2结果与讨论 /045
3.2.1产甲烷特性/045
3.2.2稻秸降解特征/048
3.3本章小结 /049

4共接种菌群在稻秸半连续厌氧发酵中的驯化/050
4.1材料与方法 /051
4.1.1接种物与稻秸原料/051
4.1.2半连续厌氧发酵运行/051
4.1.3指标分析/052
4.1.4菌群结构分析/053
4.1.5相对q-PCR/053
4.1.6统计分析/054
4.2结果与讨论 /054
4.2.1厌氧发酵特性/054
4.2.2菌群多样性变化/057
4.2.3驯化前后甲烷菌和细菌菌群结构变化/059
4.2.4甲烷菌和GH 5水解菌群数量的相对变化/062
4.2.5共接种菌群形态学特征/063
4.3本章小结 /065

5半连续条件下共接种功能菌群重塑及体系“酸败”机制/066
5.1材料与方法 /067
5.1.1接种物与秸秆原料/067
5.1.2半连续厌氧发酵运行/067
5.1.3指标分析/068
5.1.4MiSeq 16S基因测序/068
5.1.5甲烷菌绝对q-PCR/069
5.1.6沼渣金属形态分布/069
5.1.7统计分析/070
5.2结果与讨论 /070
5.2.1反应装置运行/070
5.2.2固渣组分及水解酶活变化/075
5.2.3细菌功能菌群分析/076
5.2.4不同类型甲烷菌数量变化/080
5.2.5金属形态分布的变化/082
5.2.6可利用态金属对产甲烷活性的影响/086
5.2.7功能菌群重塑及体系“酸败”原因分析/088
5.3本章小结 /090

6不同含固率和F/I比例下稻秸发酵产甲烷活性特征/092
6.1材料与方法 /093
6.1.1接种物与秸秆原料/093
6.1.2批次实验设计/093
6.1.3指标分析/094
6.1.4荧光组分分析/094
6.1.5统计分析/095
6.2结果与讨论 /095
6.2.1产甲烷动力学分析/095
6.2.2固渣组分的变化/096
6.2.3荧光组分F420与甲烷产率相关性分析/097
6.3本章小结 /099

7高固态稻秸厌氧发酵特性及嗜氢型产甲烷活性变化/101
7.1材料与方法 /102
7.1.1接种物与秸秆原料/102
7.1.2半连续厌氧发酵运行/102
7.1.3指标分析/103
7.1.4荧光组分分析/104
7.1.5甲烷菌绝对q-PCR/104
7.1.6统计分析/104
7.2结果与讨论 /104
7.2.1反应装置运行/104
7.2.2稻秸组分及水解酶活变化/107
7.2.3沼液中内源蛋白、NADH及辅酶F420的变化/109
7.2.4不同营养类型甲烷菌的变化/111
7.3本章小结 /112

附录/114
附录A基于DGGE条带序列和相似性序列构建的系统发育进化树 /114
附录B菌群系统发育进化树 /115
附录C三个阳性克隆插入片段测序序列 /116
附录D批次实验中三维荧光光谱特征 /117
附录E秸秆厌氧发酵装置结构图 /118
附录E(a)一种湿式秸秆厌氧发酵装置/118
附录E(b)一种半固态秸秆厌氧发酵装置/119
附录E(c)一种固态秸秆厌氧发酵装置/121
附录F半连续实验中三维荧光光谱特征 /121

参考文献/123