L-谷氨酰胺和L-精氨酸发酵生产（第2版）

前言
本书原版名《L-谷氨酰胺和L-精氨酸发酵生产》，此次大增大减。
凡看过原版前言的读者会了解，该书其实是作者在氨基酸发酵领域填补国内空白的两项科研成果，叙述了从菌种选育开始直到工业化生产全过程。它不全是公开发表文献的编撰，其实是首次发表的科研著作。这一传统在新版中基本得以延续。
本书专注的L-谷氨酰胺（L-GM或GM）和L-精氨酸（L-Arg或Arg）被称为21世纪氨基酸。前者国内发酵生产于2000和2001年之交，后者投产于2006年。2009年本书初版的任务是向国人介绍这两个被国内外普遍推崇氨基酸的功能及生产方法。光阴似箭，日月如梭，十多年过去了，科学家谓之人类基本营养素，占人体中游离氨基酸的61%，是人体消化道细胞的主要能源来源，靠人体肌肉分解供应的L-谷氨酰胺日益深入国人医药健康领域自不待言。后者L-精氨酸（α-氨基-δ-胍基戊酸，分子量174.20）及其前体L-瓜氨酸（Cit，α-氨基-δ-脲基戊酸，分子量175.19）则更是和“神奇的一氧化氮”（NO）紧密相连而日益深入人们生活。
1998年三位美国药学家费奇戈特、默拉特和伊格纳罗因为发现NO在生物体内的神奇作用获得诺贝尔生理学或医学奖。2011年默拉特等著书称：“NO让人们远离心脑血管疾病、高血压、高血脂、糖尿病，教您多活30年”“NO已经改变了世界1000万人的命运，未来即将改变中国千千万万人的健康。”
可以通过食用富含NO的食物摄入NO，例如三个西瓜所含L-瓜氨酸抵一颗“伟哥”，但人们不可能一次吃掉三个西瓜。L-精氨酸和L-瓜氨酸（在体内转为L-精氨酸后）进入血管壁平滑肌内皮细胞时发生酶反应使之转变为NO，是人体获得NO最直接、高效的来源。L-精氨酸碱性强，口感差，而L-瓜氨酸中性，略带甜味，可以直接口服。国内数个企业用L-精氨酸酶法生产L-瓜氨酸，出口量近两千吨。
十多年来国内发酵法生产L-谷氨酰胺和L-精氨酸，自创业开始技术进步取得显著进展。就菌种讲L-谷氨酰胺倒是变化不大仍沿用老菌种，但技术经济指标如发酵产胺率、糖转化率、提取精制收率都大幅提高。由于L-精氨酸商品价由每吨十余万元下降到4万～5万元，第一版介绍的传统诱变菌株已为基因工程菌（谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌）取代。
两产品的提取精制工艺已经赶上国际先进水平。凡此，本书第一版有关技术部分大半删除改写。又第三篇清洁生产因两产品提取精制几乎要推倒重写且清洁生产并非本书专长亦删去，故写本前言。
本书作者李炜和陶潜怡1991年毕业于上海科学技术大学（本科），现为工程师，本书第二版增加内容除引用文献外皆为他们所领导的上海聚瑞生物技术有限公司技术成果。

作者
2020.12




第一版前言
当科技部制定国家“十五”科技发展规划时，氨基酸领域只有少数几个重要品种不能配套，即俗语说的“国内生产空白”。L-谷氨酰胺（简称L-GM或GM）、L-精氨酸（简称L-Arg或Arg）即属国家“十五”规划重点研发填补空白的项目之列。
本书称L-谷氨酰胺、L-精氨酸为特殊功能氨基酸（这里指出，如没有特别说明，本书中的谷氨酰胺及精氨酸均指L型），但是并不排斥其他氨基酸的功能。例如L-脯氨酸（L-Pro）是合成优良抗高血压药开博通（Captopril，卡托普利）的原料；L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸3种氨基酸除了是必需氨基酸外，也是重要的药用氨基酸；L-色氨酸具有重要的生理功能，其生产难度较大，因而是在世界范围内紧缺的必需氨基酸。然而L-谷氨酰胺和L-精氨酸在医药、营养保健领域应用广泛、需要量大，将之称为药用氨基酸中最重要的品种，这点将越来越为人们接受。
作者长期担任上海市工业微生物研究所氨基酸和有机酸研究室副主任，在1995年上报上海市科委并下达的项目中就有L-谷氨酰胺、L-精氨酸两项，并担任L-谷氨酰胺的课题组组长。2000年底作者与诚志股份生命科技有限公司（清华大学企业集团与江西省合作成立的上市公司）进行技术合作，并于2001年初实现了L-谷氨酰胺的工业化生产（60m3发酵罐6台）。L-精氨酸发酵菌种从黄色短杆菌TA174开始到TA188再到TA189，经数年努力在国内首次实现了工业化生产（50 m3发酵罐6台）。如今我国L-谷氨酰胺大量出口美国和欧洲，年出口量数百吨，年产值数千万元人民币，稳步进入口服级产品的国际市场。
发酵法L-精氨酸刚刚形成规模，2008年产量约500t，年产值近4000万人民币，主要供应国内市场。据诚志股份生命科技有限公司2008年初提供的参考数据，2007年我国制剂药用L-精氨酸产量1585t（包括发酵法和水解法生产的），预计2008年达到1900t，2012年将达到3300t，如此巨大增长的需求量主要依靠发酵法生产来满足。从国际上看，2007年美国、日本、欧洲L-精氨酸总产量1.4万吨，因为国外强调非动物来源（non-animal），加上我国发酵法生产L-精氨酸有质优价廉的优势，所以国内发酵法生产L-精氨酸虽说是刚刚起步，但发展潜力巨大。
从技术经济指标看，L-谷氨酰胺发酵产胺率8%～9%，周期40～45h，在国际上处于领先水平。L-精氨酸发酵产酸率5%～6%，30L实验罐6.5%，10m3罐6.85%，周期70h左右，最高产酸率为8.30%，周期78h，提取精制收率60%以上，无疑居国际先进水平。由于L-谷氨酰胺、L-精氨酸的重要应用价值，氨基酸生产大型跨国公司对其技术进行保护，不对外转让技术，我国的科技人员、企业家等经过数年努力，可以取得上述成果是值得骄傲的。在本书出版之际谨向分别领导两项目实施的诚志股份总裁清华大学研究员龙大伟、大成集团福州富成味精食品有限公司总经理吴志勇表达敬意。此外也感谢与作者一起负责技术工作的江苏省食品发酵研究所高级工程师吕庆林。
本书从技术角度介绍了两项目从研发到投产的过程，从中可以看到数年中技术经济指标提高的轨迹；本书也综合介绍了两产品工艺生产过程（包括发酵、提取精制等）的工艺参数、操作要点及相应设备等。
本书介绍的是两个氨基酸空白品种如何从实验室走向工厂再进入市场的，那么哪些内容值得读者重点阅读呢？
笔者以为首先是菌种的筛选。俗话说：“戏法人人会变，各有巧妙不同，”多年来筛选代谢调控突变株已形成一套几乎固定的操作模式，在固定模式之下还可采取一些经过深思熟虑的讨巧做法，其最终目的是以较少的工作量获得性能优良的菌株。这点在黄色短杆菌SGRNO18的筛选上有所介绍。
微生物发酵是一门实验性很强的学科，从业者长年累月、默默无闻地穿梭于无菌室、实验室和摇瓶室是不待说的。变异菌种性能的表达充满变化，要全身心投入、细心观测。例如L-精氨酸发酵，对于TA188菌株需要添加L-谷氨酸前体，而笔者在一次TA188 NTG处理摇瓶发酵筛选中发现某些菌株产L-精氨酸不低，但不消耗添加的L-谷氨酸，循此意外发现TA189，使菌种筛选又前进了一步。
其次，在菌种确定之后发酵控制最优化就显得特别重要了。本书在这点上用了相当多的篇幅来加以论述。以L-谷氨酰胺为例，从2001年初投产到2007年的7年间菌种未变而发酵水平几乎提高一倍，原因何在？请读者自己揣摩。
十多年来膜技术发展迅速，本书也介绍了膜技术在L-谷氨酰胺、L-精氨酸提取精制上的应用。事实上我国发酵产品质量可与欧美、日本媲美，其中膜技术的应用功不可没。
迄今为止，我国高等院校相关专业教材及其他生物类出版物对传统的味精、L-赖氨酸发酵等介绍得较详细，但在L-谷氨酰胺、L-精氨酸方面却介绍得较少，引用文献内容也较陈旧，这是由于“巧妇难为无米之炊”。作者希望本书的出版能在一定程度上丰富高校有关专业的授课内容。
本书共分三篇，第一篇为发酵法生产L-谷氨酰胺，第二篇为发酵法生产L-精氨酸，第三篇是清洁生产设计方案。
感谢上海市工业微生物研究所老所长、中国食品协会发酵工程研究会会长、教授级高级工程师冯容保对本书写作及出版提供的支持和帮助；感谢北京协和医院蒋朱明医师的鼓励，我记得他在发酵法生产L-谷氨酰胺鉴定会上鼓励作者撰写本书，正是他主译的《基本营养素——L-谷氨酰胺》（The Ultimate Nutrient Glutamine）一书激发了我写作本书的愿望，因为我希望中国也有一本与The Ultimate Nutrient Glutamine相呼应的技术著作出版。
2008年是原无锡轻工业学院建院五十周年，谨以本书向母校表达感恩之情。

李文濂
2008年12月

李文濂，上海市工业微生物研究所，高级工程师，原无锡轻工学院食品工程系发酵工学专业本科。上海市工业微生物研究所高级工程师，氨基酸和有机酸研究室副主任。承担研发的L-谷氨酰胺、L-精氨酸发酵生产等实现了产业化。

L-谷氨酰胺和L-精氨酸被称为21世纪氨基酸，在医药、食品、饲料等领域都有重要应用。本书基于作者研究成果，系统介绍发酵法生产L-谷氨酰胺和L-精氨酸的机理、菌种选育、工艺、设备及分析检验方法，并尽可能多地介绍了这两种重要药用氨基酸的应用情况。新版对原版进行了大量删改，全面体现了这两种氨基酸的最新生产技术和应用情况。紧密联系生产实际是本书的特点。 
本书可供从事氨基酸开发、发酵生产的技术人员，以及医药行业相关专业工作者阅读参考。

第一篇发酵法生产L-谷氨酰胺
第一章L-谷氨酰胺概述2
第一节L-谷氨酰胺的重要性2
第二节L-谷氨酰胺的应用5
一、抗胃肠道溃疡5
二、动植物细胞培养生产新型生化药物及疫苗的原料5
三、特殊营养保健品6
四、饲料添加剂——动物的福星6
第三节L-谷氨酰胺在自然界的存在和性质6
第四节L-谷氨酰胺生产方法8
一、发酵法8
二、酶法9
三、化学合成法10
第五节L-谷氨酰胺的品种和规格11
一、食用级L-谷氨酰胺11
二、药用级L-谷氨酰胺12

第二章L-谷氨酰胺发酵菌种14
第一节L-谷氨酰胺的生物合成途径和L-谷氨酰胺生产菌的基本生化特性14
一、由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径14
二、由L-谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺14
三、L-谷氨酸（L-谷氨酰胺）产生菌的基本生化特征14
四、黄色短杆菌磺胺胍抗性株（SGR）的生化特征16
五、环境因素在L-谷氨酰胺发酵中的作用17
第二节L-谷氨酰胺生产菌的微生物特性19
一、黄色短杆菌ATCC14067的微生物特性19
二、栖糖蜜棒杆菌的微生物特性20
第三节黄色短杆菌磺胺胍抗性突变株的选育20
一、培养基组成20
二、诱变处理21
三、磺胺胍抗性菌（SGR）的筛选21
四、黄色短杆菌SGRNO18摇瓶发酵实验22
第四节栖糖蜜棒杆菌DON抗性突变株的选育25
一、培养基组成25
二、诱变处理及DONR的筛选25
三、DONR摇瓶发酵实验26

第三章L-谷氨酰胺发酵工艺28
第一节发酵用原料28
一、碳源28
二、氮源37
三、有机氮源和生长因子38
四、无机盐42
五、消泡剂43
第二节种子培养43
一、摇瓶种液的制备43
二、种子罐扩大培养44
第三节50m3罐发酵及发酵条件控制45
一、发酵培养基及配料45
二、50m3罐批报举例46
三、发酵控制的主要参数48
四、黄色短杆菌SGRNO18发酵条件控制总结53
五、十多年来发酵水平的提高54
第四节氨基酸发酵杂菌和噬菌体的防止56
一、染菌56
二、噬菌体57

第四章发酵设备、功率消耗和传氧系数59
第一节发酵罐59
一、通用式发酵罐59
二、空气提升式发酵罐64
第二节通气搅拌功率及传氧系数65
一、发酵罐搅拌功率65
二、与溶解氧有关参数的测定与计算67
三、溶解氧控制实例71
第三节发酵过程中热化学的动力分析及冷却列管面积计算78
一、发酵热78
二、发酵过程热化学分析79
第四节与发酵罐配套的传感器80
一、溶解氧电极80
二、pH电极81
三、热磁式氧分析仪81
四、热导式CO2分析器82

第五章L-谷氨酰胺的提取及精制83
第一节L-谷氨酰胺的提取精制的难点83
一、L-谷氨酰胺特殊的化学性质83
二、L-谷氨酰胺特殊的生物学性质84
三、高浓度（NH4）2SO4对提取精制的影响84
四、L-谷氨酰胺和L-谷氨酸以及甘氨酸等较易结晶纯化氨基酸的比较85
五、L-谷氨酰胺极易被杂菌分解86
第二节L-谷氨酰胺的溶解度86
一、溶解度 86
二、在水中溶解度计算式86
第三节提取精制工艺过程87
一、发酵液去菌体及清液纯化87
二、模拟移动床色谱分离技术在L-谷氨酰胺等中性氨基酸发酵液提取精制上的应用91
三、L-谷氨酰胺发酵液电渗析法提取精制实践98
第四节浓缩和结晶104
一、常规减压浓缩结晶104
二、冷冻浓缩或冷冻结晶107
第五节主要提取精制设备及计算109
一、单效升膜式薄膜蒸发器109
二、7m3内加热浓缩结晶锅110

第六章L-谷氨酰胺生产的分析检验方法111
第一节L-谷氨酰胺发酵液分析111
一、发酵液中L-谷氨酰胺的定量111
二、发酵液中残糖的测定116
第二节成品分析118
一、感官指标及堆积密度118
二、比旋光度测定118
三、溶液的透光度119
四、酸度119
五、含量的测定119
六、干燥失重测定120
七、灼烧残渣121
八、重金属含量测定121
九、含砷量测定123
十、氯化物含量测定125
十一、硫酸盐含量测定126
十二、铵含量测定127
十三、铁含量测定128
十四、其他氨基酸测定129

第二篇发酵法生产L-精氨酸
第七章L-精氨酸概述132
第一节L-精氨酸的生理功能及其应用132
一、L-精氨酸的生理功能133
二、L-精氨酸的应用134
第二节L-精氨酸的存在及理化性质139

第八章L-精氨酸的生产方法141
第一节水解法141
一、从胱氨酸母液中提取L-精氨酸142
二、猪毛、蹄甲、血粉提取碱性氨基酸143
第二节发酵法144
一、国内外L-精氨酸发酵的研究进展144
二、用黏质沙雷菌生产L-精氨酸145
三、用L-谷氨酸产生菌的代谢调控突变株生产L-精氨酸150
四、L-精氨酸生物合成途径及其调节机制153
第三节产品规格156
一、L-精氨酸碱156
二、L-精氨酸·盐酸盐157

第九章谷氨酸棒杆菌TA189构建基因工程菌的发酵生产158
第一节谷氨酸棒杆菌代谢调控突变株TA189发酵生产回顾158
一、50m3罐批报（2006年10月）158
二、100m3罐批报（2011年5月）160
三、谷氨酸棒杆菌TA189的发酵性能回顾161
第二节高产菌株选育从诱变到基因工程构建的转变161
第三节从基因工程构建角度看代谢调控突变株生物合成L-精氨酸机制165
第四节谷氨酸棒杆菌TA189/AR4的产L-精氨酸水平166
一、L-精氨酸基因工程菌发酵生产的有机氮源166
二、谷氨酸棒杆菌TA189/AR4的产L-精氨酸水平举例167
三、菌体酶解物的发酵稳产作用168
四、NADPH与L-精氨酸生物合成177
第五节谷氨酸棒杆菌TA189/AR4 L-精氨酸高强度发酵178
一、几种氨基酸对长菌和产酸的促进178
二、H3PO4及L-天冬氨酸协同效应及机制分析181
第六节杜绝玉米浆中芽孢杆菌危害184

第十章大肠杆菌基因工程菌发酵生产187
第一节大肠杆菌工程菌发酵产酸水平187
一、各种培养基的配制187
二、种子培养及发酵条件控制188
三、用味精末道母液硫酸水解液代替L-谷氨酸和硫酸铵190
第二节重组大肠杆菌L-精氨酸发酵中传质的重要性及其对发酵罐的要求191
第三节扩大内需新的增长点193

第十一章发酵液中L-精氨酸的提取和精制195
第一节顺序式模拟移动床连续离子交换举例195
第二节电渗析透过法197
一、概述197
二、L-精氨酸发酵液电渗析透过法工业生产应用方案简述199
第三节浓缩结晶和节汽降成本200
一、纳滤膜浓缩200
二、单效浓缩结晶锅用热水代蒸汽作为加热介质201

第十二章L-精氨酸生产的分析检验方法203
第一节发酵液中L-精氨酸含量测定203
一、直接比色法203
二、酶法205
三、高效液相色谱法206
第二节成品分析207
一、感官指标208
二、L-精氨酸含量测定208
三、比旋光度209
四、溶状（透光率）210

参考文献211

附录213
附录一氨基酸在不同温度的水中的溶解度213
附录二各种氨基酸对水的溶解度（S）计算公式214
附录三氨基酸的燃烧热215
附录四氨基酸的若干物理化学性质216
附录五在不同温度及压力下空气在水中的饱和溶解度表218
附录六真空度与水的沸点对照表218
附录七氨水的相对密度与浓度（20℃）关系219
附录八醋酸缓冲液220
附录九磷酸盐缓冲液221