PCR最新技术原理、方法及应用（第三版）

从《PCR最新技术原理、方法及应用》一书第二版出版以来，已经过去了十个年头了。在此期间随着生命科学技术的发展，又衍生了一些新的PCR方法，这次再版的目的是想及时地将它们介绍给读者。在这版中对上一版的部分章节进行了修改和补充。在方法方面，增加了恒温PCR一章，该方法的优点是在一个温度下即可完成PCR，不需要常规PCR的变性、复性和延伸三个温度，不需要昂贵的PCR仪，适用于现场作业。另外，对第二版第九章进行了改写，其中补充的微流控微滴数字PCR方法的优点是使用的样本极少，定量比常规的实时荧光定量PCR更精确，而且比以往任何的PCR方法灵敏度高。在应用方面，也进行了扩展，上两版主要集中在人类和动物方面的应用，本版的内容包括了在植物学、大家畜（猪、牛、羊）以及水生动物方面的应用，还增加了PCR在转基因动物方面的应用。
本书仍按照前两版的编排方式，前面部分分别介绍各个PCR方法，后面部分介绍各PCR方法在各个领域中的应用。读者在寻找符合自己实验目的的方法时，可分别在方法部分和应用部分寻找，因为有的PCR方法在前面部分并没有单独进行详细介绍，但在应用部分进行了介绍。
为了使读者能更好地掌握PCR方法，我们在编写时力图使提供的方法尽可能详细，对每一种方法提供了详细的反应体系和反应条件，但读者在具体应用时，也不宜照本宣科，应在实验过程中因势制定，对实验条件进行必要的优化。本书适用于所有从事生命科学的工作者。 
本书由军事科学院军事医学研究院生物工程研究所、微生物流行病研究所，首都儿科研究所，中国食品药品检定研究院，海军总医院和中国疾病预防控制中心传染病预防控制所等机构的中青年科技工作者和博士研究生撰写，尽管他们工作在第一线，但毕竟年轻、水平有限，加上时间仓促，书中难免有疏漏和不妥之处，恳请读者指正。

王恒樑
军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

王恒樑，军事科学院军事医学研究院生物工程研究所副所长、研究员，病原微生物生物安全国家重点实验室副主任，博士生导师。一直从事病原细菌致病机理和基因工程疫苗研究。曾获国家自然科学杰出青年基金、国务院政府特殊津贴、科协求是杰出青年奖、科技部和盖茨基金联合颁发首届“大挑战2015·青年科学家”，入选国家百千万人才工程，获“有突出贡献中青年专家”称号。

《PCR最新技术原理、方法及应用》（第三版）系统介绍各种PCR技术及其在各个领域中的应用，涵盖了最新发展的技术。第三版对第二版进行了修订和补充。例如，在方法方面增加了恒温PCR，该方法在一个温度下即可完成PCR，不需要昂贵的PCR仪，适用于现场作业；增加了微流控微滴数字PCR方法，该法的优点是使用的样本极少，定量比常规的实时荧光定量PCR更精确，而且灵敏度高。在应用方面，新版包括了PCR技术在植物学、大家畜和水生动物方面的应用，以及在转基因动物方面的应用。
本书是关于PCR技术的全面实验手册，可供所有从事生命科学研究的科技工作者、教师和研究生阅读参考。

第一章绪论001
第一节PCR发展简史001
第二节PCR技术的基本原理和操作002
一、PCR的基本原理002
二、PCR的基本成分002
三、PCR的基本操作005
第三节PCR的主要应用006
一、基础研究方面的应用006
二、临床上的应用007
三、在法医学中的应用008
四、在其它方面的应用008
参考文献009

第二章扩增已知序列两侧DNA的PCR011
第一节反向PCR011
一、引言011
二、基本原理011
三、材料012
四、方法013
五、注意事项014
六、应用015
七、小结017
第二节锚定PCR018
一、引言018
二、原理018
三、用连接锚定PCR从基因文库中扩增已知基因侧翼序列020
四、用互补锚定PCR直接扩增已知序列侧翼cDNA序列021
五、问题及对策025
六、小结026
第三节RACE——cDNA末端的快速扩增027
一、引言027
二、RACE基本原理028
三、实验方案030
四、RACE的应用033
五、小结034
第四节连接介导的PCR034
一、引言034
二、原理034
三、材料035
四、操作步骤035
五、注意事项038
六、应用039
七、小结042
第五节Bubble-PCR042
一、引言042
二、原理042
三、材料与方法043
四、注意事项044
五、应用045
六、小结045
参考文献045

第三章巢式PCR048
第一节常规巢式PCR048
一、引言048
二、原理048
三、材料049
四、方法049
五、注意事项050
六、应用与小结050
第二节半巢式PCR050
一、引言050
二、材料050
三、方法051
四、注意事项051
五、应用与小结052
第三节反转录巢式PCR052
一、引言052
二、材料052
三、方法052
四、注意事项054
五、应用054
第四节共有序列巢式PCR054
一、引言054
二、材料055
三、方法055
四、注意事项056
五、应用与小结056
第五节种特异巢式PCR056
一、引言056
二、材料057
三、方法057
四、注意事项058
五、应用与小结058
第六节巢式PCR-变性梯度凝胶电泳058
一、引言058
二、材料059
三、方法059
四、注意事项060
五、应用与小结060
第七节巢式PCR-限制性片段长度多态性061
一、引言061
二、材料061
三、方法062
四、注意事项063
五、应用与小结063
参考文献063

第四章实时荧光定量PCR065
第一节实时荧光定量PCR原理065
一、引言065
二、概念及原理065
第二节实时荧光定量PCR中的荧光化学物质067
一、引言067
二、荧光染料067
三、水解探针068
四、分子信标069
五、双杂交探针071
六、复合探针071
第三节实时荧光定量PCR的定量方法072
一、绝对定量072
二、相对定量073
第四节实时荧光定量PCR的实验方法076
一、实时荧光定量PCR076
二、实时定量RT-PCR079
三、多重实时定量PCR081
四、多重实时定量RT-PCR084
五、实验方案的优化086
六、实践中应注意的问题087
第五节实时荧光定量PCR技术的应用088
一、在病原体检测中的应用089
二、在肿瘤研究中的应用090
三、在基因表达研究中的应用092
四、在细胞因子表达分析中的应用092
五、在遗传学及SNP分析上的应用092
六、小结093
参考文献094

第五章致突变PCR097
第一节利用易错DNA聚合酶进行随机突变098
一、原理098
二、实验方案098
三、注意事项100
四、讨论100
五、应用101
第二节利用PCR引物构建位点特异突变体102
一、方法1：利用重叠延伸PCR构建定点突变体102
二、方法2：利用大引物PCR构建定点突变体105
三、方法3：利用重组PCR进行扫描突变107
四、讨论111
五、应用112
六、小结113
参考文献113

第六章测定基因突变的PCR115
第一节多重PCR115
一、引言115
二、原理116
三、材料116
四、方法116
五、常见问题的解决120
六、应用121
七、小结128
第二节常用的等位基因特异性PCR128
一、引言128
二、原理129
三、材料130
四、方法130
五、注意事项131
六、对等位基因特异PCR的改进131
七、应用与小结132
第三节简单等位基因辨别PCR133
一、引言133
二、原理133
三、材料134
四、方法135
五、注意事项136
六、应用与小结136
第四节L-DNA标记的等位基因特异性PCR136
一、引言136
二、原理137
三、材料137
四、方法138
五、注意事项139
六、应用与小结139
第五节同源一步荧光等位基因特异性PCR139
一、引言139
二、原理139
三、材料140
四、方法141
五、注意事项142
六、应用与小结142
第六节低温变性共扩增PCR142
一、引言142
二、原理143
三、材料144
四、方法144
五、小结145
第七节限制性片段长度多态性PCR145
一、原理145
二、材料145
三、操作方法146
四、注意事项147
五、应用148
第八节PCR-变性梯度凝胶电泳149
一、原理149
二、材料149
三、操作方法149
四、注意事项151
五、应用151
参考文献152

第七章测序和DNA合成PCR156
第一节不对称PCR156
一、引言156
二、引物浓度不对称PCR156
三、热（引物长度）不对称PCR158
四、应用162
五、小结163
第二节PCR测序法164
一、直接测序法164
二、循环测序法165
三、全自动DNA测序法167
四、应用167
第三节乳化液PCR168
一、引言168
二、原理168
三、材料和方法169
四、应用177
五、小结177
第四节基于PCR的大片段DNA的合成177
一、引言177
二、基本原理178
三、目的序列、寡核苷酸和测序引物的设计178
四、操作步骤180
五、DNA合成时常出现的问题及解决办法184
六、小结184
参考文献184

第八章免疫PCR188
第一节免疫PCR技术188
一、引言188
二、基本原理188
三、材料和试剂190
四、方法191
五、注意事项196
六、应用197
七、小结198
第二节免疫捕捉PCR198
一、引言198
二、基本原理198
三、材料199
四、方法199
五、注意事项201
六、应用202
七、小结204
第三节PCR-ELISA205
一、引言205
二、原理205
三、材料206
四、方法207
五、注意事项208
六、应用208
七、小结211
第四节原位PCR211
一、引言211
二、基本原理211
三、原位PCR方法分类及其设计方案212
四、原位PCR基本步骤214
五、原位PCR方法的选择216
六、原位PCR操作注意事项217
七、原位PCR存在的问题和结果分析218
八、原位PCR的应用219
九、原位PCR操作程序示例220
十、小结222
参考文献223

第九章PCR芯片227
第一节PCR芯片的结构及其工作原理227
一、引言227
二、原理227
三、方法230
四、应用230
五、小结231
第二节纳升高通量PCR231
一、引言231
二、原理232
三、材料232
四、方法233
五、注意事项233
六、应用234
七、小结234
第三节微流控PCR234
一、引言234
二、原理235
三、材料（以不对称螺旋管芯片微流控PCR为例）236
四、方法（以不对称螺旋管芯片微流控PCR为例）236
五、应用236
六、小结237
第四节连续流热梯度PCR237
一、引言237
二、原理237
三、材料238
四、操作方法238
五、注意事项238
六、应用238
七、小结239
第五节PCR芯片的应用239
一、引言239
二、应用240
三、注意事项242
四、小结243
参考文献243

第十章数字PCR实验方法245
第一节数字PCR概述245
一、引言245
二、数字PCR系统分类247
第二节数字PCR技术关键点分析249
一、PCR微流控芯片249
二、连续流PCR微流控芯片251
三、微滴PCR技术252
四、微阀、微泵和微混合器与PCR微流控芯片的关系255
五、dPCR与液滴微流控芯片的结合和应用256
第三节数字PCR的应用257
一、在突变检测方面的应用257
二、病毒载量的绝对定量操作方法271
参考文献277

第十一章核酸恒温扩增技术的原理、方法及应用278
第一节聚合酶螺旋扩增技术的原理、方法及应用280
一、基本原理280
二、方法281
三、结果分析286
四、注意事项289
五、小结289
第二节环介导等温扩增技术的原理、方法及应用289
一、基本原理290
二、方法292
三、结果分析299
四、注意事项302
五、应用302
六、小结302
第三节重组酶聚合酶扩增技术的原理、方法及应用304
一、基本原理304
二、器材306
三、实验方法306
四、结果分析309
五、注意事项311
六、应用312
七、小结313
参考文献313

第十二章其它PCR方法316
第一节高（G＋C）含量DNA的PCR扩增316
一、使用增强剂改善高（G＋C）含量DNA模板的PCR扩增317
二、NaOH对模板进行预处理改善高（G+C）含量DNA的PCR扩增320
三、利用高温PCR体系改善高（G+C）含量DNA模板的PCR扩增321
四、应用322
五、小结322
第二节长片段PCR323
一、引言323
二、原理323
三、材料323
四、方法324
五、注意事项325
六、应用327
七、小结329
第三节利用热激活引物进行热启动PCR330
一、引言 330
二、原理330
三、材料331
四、方法331
五、注意事项333
六、应用333
七、小结336
第四节融合PCR337
一、引言337
二、融合PCR的原理337
三、应用于基因插入的融合PCR的具体操作步骤337
四、融合PCR的应用338
五、融合PCR操作方法的注意事项341
六、小结343
第五节不依赖连接反应的克隆PCR343
一、引言343
二、基本原理343
三、材料345
四、方法346
五、注意事项346
六、应用346
第六节菌落PCR348
一、引言348
二、原理348
三、材料349
四、操作方法349
五、注意事项349
六、应用349
七、小结350
参考文献350

第十三章PCR在基因分型中的应用353
第一节任意引物PCR353
一、引言353
二、任意引物PCR的基本原理及技术特点353
三、AP-PCR 方法354
四、RAP-PCR方法355
五、注意事项356
六、应用356
七、小结361
第二节通用PCR361
一、引言361
二、原理361
三、材料362
四、方法362
五、注意事项363
六、应用364
七、小结365
第三节rep-PCR365
一、引言365
二、原理366
三、材料366
四、方法366
五、注意事项369
六、应用370
七、小结372
第四节序列特异性引物PCR372
一、引言372
二、原理373
三、材料373
四、方法373
五、注意事项376
六、应用与小结376
第五节简单序列重复区间PCR376
一、引言376
二、原理377
三、材料377
四、方法378
五、注意事项379
六、应用379
七、小结380
第六节钳制PCR380
一、引言380
二、原理380
三、材料381
四、方法381
五、注意事项382
六、应用382
第七节序列特异性寡核苷酸多态性PCR382
一、原理382
二、试剂383
三、方法384
四、注意事项387
五、应用388
参考文献389

第十四章PCR在临床诊断及流行病调查中的应用394
第一节表位特异PCR394
一、引言394
二、原理394
三、材料394
四、方法395
五、应用395
六、小结395
第二节双标记PCR396
一、引言396
二、原理396
三、材料396
四、方法397
五、应用397
六、注意事项397
第三节降落PCR397
一、引言397
二、原理398
三、材料398
四、方法398
五、降落PCR与常规PCR的比较399
六、应用401
七、小结402
第四节16S rRNA PCR402
一、引言402
二、原理402
三、材料及设备403
四、方法403
五、注意事项405
六、应用405
七、小结407
第五节PCR偶联连接酶链式反应407
一、原理407
二、材料408
三、方法409
四、注意事项410
五、应用411
第六节快速PCR412
一、引言412
二、原理412
三、实验方法414
四、应用416
五、小结417
第七节稀有限制性位点PCR418
一、引言418
二、原理418
三、材料420
四、方法420
五、注意事项421
六、应用422
七、小结422
参考文献423

第十五章PCR在法医学中的应用426
第一节小卫星可变重复序列PCR426
一、引言426
二、原理427
三、方法428
四、应用431
五、小结433
第二节短串联重复序列的PCR433
一、引言433
二、原理434
三、材料435
四、方法436
五、注意事项440
六、应用441
七、小结442
第三节单核苷酸多态性PCR444
一、引言444
二、原理445
三、材料及方法447
四、SNP-PCR检测方法448
五、数据库451
六、应用452
七、小结454
第四节全基因组PCR455
一、引言455
二、全基因组PCR的种类455
三、基因组DNA模板的制备460
四、不同WGA方法的比较461
五、WGA的产物分析及应用461
六、小结464
第五节单分子PCR464
一、引言464
二、原理465
三、材料465
四、方法465
五、注意事项465
六、SM-PCR的应用466
七、小结467
参考文献467

第十六章PCR在癌症诊断中的应用474
第一节甲基化特异PCR474
一、引言474
二、基本原理474
三、材料475
四、方法475
五、注意事项477
六、应用478
七、小结479
第二节差异显示PCR479
一、引言479
二、原理480
三、方法481
四、应用484
五、小结487
第三节PCR-单链构象多态性487
一、原理487
二、材料488
三、方法488
四、注意事项490
五、应用491
第四节单细胞PCR492
一、引言492
二、基本原理493
三、材料和方法493
四、注意事项497
五、应用498
六、小结498
第五节PCR检测肿瘤细胞端粒酶活性498
一、引言498
二、基本原理499
三、材料499
四、方法500
五、注意事项501
六、应用502
七、小结与展望502
参考文献503

第十七章PCR在动物学中的应用507
第一节微卫星PCR在动物分类和进化中的应用507
一、引言507
二、基本原理507
三、材料508
四、方法508
五、注意事项509
六、应用509
七、小结510
第二节巢式PCR在动物疾病诊断中的应用510
一、引言510
二、基本原理510
三、材料511
四、方法511
五、注意事项512
六、应用512
七、小结513
第三节T接头介导PCR在转基因动物外源基因定位中的应用513
一、引言513
二、原理513
三、材料514
四、方法514
五、注意事项515
六、应用516
七、小结516
第四节等温扩增技术在动物学中的应用516
一、引言516
二、基本原理516
三、材料518
四、方法519
五、注意事项520
六、应用520
七、小结521
参考文献521

第十八章PCR技术在基因修饰动物研究中的应用523
第一节PCR技术在基因修饰动物基因型鉴定中的应用523
一、引言523
二、基本原理524
三、材料524
四、方法524
五、注意事项526
第二节PCR技术用于转基因动物细胞中外源基因整合位点的分析526
一、方案一：反向PCR527
二、方案二：连接介导PCR法528
三、方案三：热不对称交错PCR529
第三节PCR技术用于转基因动物细胞中外源基因整合拷贝数的分析532
一、方案一：实时荧光定量PCR比较CT法检测转基因动物中外源基因的拷贝数532
二、方案二：实时荧光定量PCR标准曲线绝对定量法检测转基因动物中外源基因的拷贝数534
三、方案三：利用微滴数字PCR分析转基因动物中外源基因的拷贝数535
参考文献537

第十九章实时荧光定量PCR在动物疫病定量检测中的应用538
第一节实时荧光定量PCR在大家畜（猪、牛、羊）传染病中的诊断应用538
一、引言538
二、原理538
三、器材540
四、方法540
五、注意事项541
六、应用543
七、小结545
第二节实时荧光定量PCR在家禽传染病（禽流感）中的诊断应用545
一、引言545
二、原理546
三、材料547
四、方法547
五、结果分析548
六、注意事项548
七、应用549
八、小结550
第三节实时荧光定量PCR在水生动物疫病定量检测中的应用550
一、引言550
二、基本原理550
三、材料550
四、方法551
五、注意事项552
六、应用552
七、小结554
参考文献555

第二十章PCR在植物学中的应用557
第一节ISSR-PCR在植物分类学中的应用557
一、引言557
二、基本原理557
三、材料557
四、方法558
五、注意事项559
六、应用559
七、小结566
第二节TAIL-PCR在转基因植物研究中的应用567
一、引言567
二、基本原理567
三、材料568
四、方法568
五、注意事项569
六、应用570
七、小结575
第三节多重PCR在植物基因检测中的应用575
一、引言575
二、基本原理576
三、多重PCR的实验方法576
四、多重PCR设计方法及注意事项577
五、多重PCR在植物生物学研究中的应用579
六、多重PCR应用前景580
参考文献580