GlnR和Fnr介导植物乳杆菌WU14的Nir表达调控机制

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物，随着人们食品安全意识的提高，腌制食品中亚硝酸盐污染的安全问题日益受到关注，这也是腌制食品生产中普遍面临的问题。因此，如何降解亚硝酸盐是腌制食品生产中亟待解决的关键问题，也是食品安全领域的研究热点。
作者及其团队成员在国家自然科学基金、江西省自然科学基金、江西省科技支撑计划项目、广东省自然科学基金、广东省普通高校重点领域专项等项目的资助下，长期开展乳酸菌来源的食品级亚硝酸盐还原酶动态降解食品腌制过程中所产生的亚硝酸盐的理论和技术研究，在乳酸菌功能基因挖掘和基因调控、氮代谢和稀有糖生物转化等领域取得了一系列的成绩，在乳酸菌GlnR调控GAD机制、GlnR与Nir相互作用及表达调控机制、Fnr和Fur参与植物乳杆菌WU14亚硝酸盐降解的调控机制和高产D-塔格糖工程菌株构建与生物转化、耐热性和N-糖基化分子改良提高植物乳杆菌WU14 L-阿拉伯糖异构酶催化效率等方面取得了积极成果，在国内外高水平期刊上发表了数十篇学术论文，授权了多项国家发明专利，研究成果为乳酸菌氮代谢调控研究和亚硝酸盐生物降解的发展提供了理论指导和技术支撑。
本书是对植物乳杆菌WU14全局性调控蛋白GlnR和Fnr对Nir表达调控机制研究的系列成果的总结。全书分为7章，比较系统地从理论和技术等方面介绍了植物乳杆菌WU14利用亚硝酸盐还原酶生物动态降解亚硝酸盐的基因调控机制，具体是在系统介绍腌制食品中亚硝酸盐对人体的危害、亚硝酸盐还原酶的分类和功能以及植物乳杆菌的氮代谢调控因子GlnR和Fnr研究现状的基础上，详细介绍了植物乳杆菌WU14的Nir基因的食品级细胞内高效诱导表达、Fnr和GlnR的重组表达和纯化、Fnr和GlnR与Nir启动子的相互作用以及Fnr和GlnR与Nir的相互作用与表达调控机制。
本书由广东石油化工学院徐波教授撰写。本书撰写过程中，中国农业科学院姚斌院士、石鹏君研究员、伍宁丰研究员、张伟研究员等给予了大力支持，应碧、昌晓宇、罗艳、孙志军、曾浩、缪婷婷、邱胡林和沈风飞等研究生也为本书的完成付出了辛勤的劳动，在此表示衷心感谢！
本书是作者研究团队对乳酸菌亚硝酸盐还原酶动态降解亚硝酸盐的基因和表达调控的分子机制研究的成果总结，期望能为食品微生物和益生菌研究领域的学者和学生提供一点理论和技术上的帮助。
限于作者水平，书中难免存在疏漏之处，敬请读者批评指正。

徐波
2023年8月

徐波，1970年生，广东石油化工学院教授，工学博士，一直致力于乳酸菌功能基因挖掘、乳酸菌基因工程和乳酸菌氮代谢基因调控等方面的研究工作。先后主持完成包括3项国家自然基金在内的多项研究课题，主持完成6项本科生、研究生教改项目，发表学术论文46篇，其中SCI论文12篇，获教学成果二等奖1项，出版中文教材2部，申请发明专利3项。

本书为作者团队多年从事乳酸菌分子生物学和基因调控研究系列成果的总结。以植物乳杆菌WU14为研究对象，以乳酸菌亚硝酸盐还原酶系统的调控为突破口，主要探讨了乳酸菌氮代谢全局性调控蛋白GlnR和Fnr对亚硝酸还原酶Nir的调控机制，从转录水平和基因表达上着手分析亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14全局性转录调控蛋白GlnR和Fnr及Nir对氧感应机制，验证了Fnr与Nir和nir启动子以及Fnr与GlnR的相互作用，阐明了GlnR和Fnr对nir操纵子的多层次表达调控机理，以期为构建乳酸菌氮代谢的基因转录网络、明确基因转录的相互调控关系和关键调控基因提供理论和技术支持。
本书主要面向食品微生物发酵和应用研究的科研工作者，特别适用于乳酸菌功能基因挖掘和基因调控研究领域的科研工作者，期望能够对食品微生物和益生菌分子生物学等科研工作者的研究提供帮助。

第1章绪论001
1.1亚硝酸盐与食品001
1.1.1亚硝酸盐在食品行业的应用001
1.1.2亚硝酸盐对人体的危害001
1.1.3酱腌菜和泡菜中亚硝酸盐的产生与控制002
1.2亚硝酸盐还原酶002
1.2.1亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐途径002
1.2.2亚硝酸盐还原酶的分类003
1.2.3亚硝酸盐还原酶的功能003
1.3植物乳杆菌003
1.3.1植物乳杆菌的功能004
1.3.2植物乳杆菌的脱氮能力004
1.3.3植物乳杆菌在酱腌菜和泡菜中的应用004
1.3.4植物乳杆菌WU14005
1.4细菌氮代谢研究005
1.4.1调控因子与启动子的相互作用005
1.4.2GlnR调控因子006
1.4.3Fnr调控因子010
1.4.4Fnr调控因子对细菌氮代谢的调控010
1.4.5luxS和HK等全局性调控因子对亚硝酸盐代谢的调控010
1.5植物乳杆菌遗传转化体系011
1.5.1国内外研究进展011
1.5.2工业应用011
参考文献012

第2章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14的Nir食品级高效诱导表达及其酶学性质研究020
2.1亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14对亚硝酸盐降解能力分析021
2.2Nir基因克隆和生物信息学分析022
2.3重组质粒pRNA48-Nir的构建及Nir诱导表达026
2.4植物乳杆菌WU14的基因组测序和分析029
2.5结论030
参考文献030


第3章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14中GlnR与Nir相互作用研究032
3.1Trans 1/pET-30a/Nir表达载体的构建与检测034
3.1.1亚硝酸盐还原酶保守片段Nir的获取034
3.1.2Nir诱导表达载体的构建034
3.1.3Nir蛋白诱导与SDS-PAGE分析034
3.2植物乳杆菌GlnR基因克隆和表达载体的构建与检测036
3.2.1T3-glnR构建036
3.2.2pET-30a-glnR的表达载体构建036
3.3GlnR与Nir启动子体外相互作用研究037
3.3.1pNir启动子基因扩增及Trans1/T3/pNir菌落PCR验证037
3.3.2GlnR基因片段的重新获得037
3.3.3诱饵载体与表达载体的构建038
3.3.4细菌单杂交实验诱饵载体与表达载体酶切验证039
3.4结论043
参考文献044

第4章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14中GlnR与Nir表达调控机制研究046
4.1利用酵母双杂交研究GlnR与Nir的互作与表达调控046
4.1.1亚硝酸盐还原酶（Nir）基因和GlnR基因的克隆046
4.1.2GlnR-pGBKT7诱饵载体和报告载体Nir-pGADT7的构建046
4.1.3菌落PCR检测重组载体pAD-Nir和pBD-GlnR047
4.1.4融合载体的自激活和毒性检测047
4.1.5亚硝酸盐还原酶（Nir）和调控蛋白GlnR相互作用分析048
4.1.6植物乳杆菌WU14 RNA的提取048
4.2凝胶阻滞验证GlnR蛋白与Nir互作和表达调控049
4.2.1PCR扩增GlnR基因050
4.2.2pPIC9-GlnR表达载体的构建051
4.2.3SDS-PAGE分析重组载体pPIC9-GlnR的表达产物051
4.2.4pE-T30a-GlnR表达载体的构建051
4.2.5GlnR蛋白的诱导表达与纯化052
4.2.6GlnR蛋白与亚硝酸盐还原酶（Nir）的相互作用053
4.3qRT-PCR实验分析亚硝酸盐胁迫GlnR对Nir的表达调控作用053
4.3.1WU14生长曲线测定054
4.3.2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）054
4.4结论057
参考文献059

第5章Fnr参与植物乳杆菌WU14亚硝酸盐降解的调控机制061
5.1Fnr和GlnR的重组表达和纯化061
5.1.1fnr和glnR基因扩增及序列分析061
5.1.2Fnr和GlnR克隆载体的构建062
5.1.3Fnr和GlnR重组表达质粒的构建063
5.1.4Fnr和GlnR重组蛋白的诱导表达、纯化和检测064
5.2凝胶阻滞（EMSA）验证Fnr和GlnR与nir启动子的相互作用067
5.2.1PglnR和Pnir启动子序列的扩增生物素标记067
5.2.2EMSA验证Fnr与Pnir启动子的互作068
5.2.3EMSA验证GlnR和Pnir启动子的互作069
5.2.4EMSA验证Fnr和PglnR启动子的互作069
5.3qRT-PCR验证fnr和nir的相对表达量070
5.3.1不同培养条件下植物乳杆菌WU14的生长曲线070
5.3.2植物乳杆菌WU14降解NaNO2能力测试072
5.3.3植物乳杆菌WU14的RNA提取073
5.3.4RNA反转录074
5.3.5fnr和nir相对表达量验证074
5.4结论076
参考文献078

第6章植物乳杆菌WU14 L-阿拉伯糖异构酶分子生物学、发酵工艺优化及热稳定性分子改良079
6.1高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-AI基因的分析、食品级诱导表达及其酶学性质的研究080
6.1.1植物乳杆菌WU14生物转化D-塔格糖分析081
6.1.2L-AI基因的扩增与TA克隆081
6.1.3高产D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析082
6.1.4高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二级结构预测分析083
6.1.5高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信号肽分析084
6.1.6高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三级结构预测分析084
6.1.7高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-AI酶学性质研究085
6.1.8重组PCR技术去除植物乳杆菌WU14 L-AI基因中的NcoⅠ酶切位点088
6.1.9重组质粒pRNA48-L-AI的构建及验证090
6.1.10SDS-PAGE筛选nisin诱导L-AI基因表达的最佳诱导剂量及诱导时间092
6.1.11L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重组菌的遗传稳定性分析094
6.1.12L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重组菌的L-AI酶学性质研究095
6.2植物乳杆菌WU14高产D-塔格糖的发酵工艺优化和分离提纯研究098
6.2.1L-AI发酵动力学模型研究098
6.2.2D-塔格糖分离纯化的研究102
6.2.3硼酸盐催化L-AI产D-塔格糖的研究106
6.3植物乳杆菌WU14的L-AI耐热性分子改良108
6.3.1L-AI同源建模110
6.3.2突变位点的预测111
6.3.3突变体的表达112
6.3.4野生型及突变型L-AI最适温度及热稳定性的测定112
6.3.5野生型及突变型L-AI最适pH及pH稳定性的测定114
6.4结论114
参考文献118

第7章植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白质表达以及生物信息学分析122
7.1植物乳杆菌WU14的8个β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆123
7.2SDS-PAGE分析重组蛋白123
7.3目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14的生物信息学分析125
7.3.1氨基酸序列分析、跨膜结构和信号肽预测125
7.3.2氨基酸序列比对分析及系统发育树分析126
7.3.3蛋白质二级结构预测128
7.3.4亚细胞定位128
7.4结论129
参考文献129