酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的研究与应用

本书主要围绕β-葡萄糖苷酶的酶学性质表征和催化机理研究展开。书中以酒酒球菌产β-葡萄糖苷酶为出发点，首先分析了β-葡萄糖苷酶之间的进化水平和同源关系，其次又通过异源表达技术得到重组β-葡萄糖苷酶，并进一步探究了该重组酶的酶学性质、结构和催化机理，为提高β-葡萄糖苷酶的催化效率提供了理论依据。此外，本书还以商业β-葡萄糖苷酶作为对比，分析了重组β-葡萄糖苷酶对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响，拓宽了该重组酶在食品发酵工业的应用前景。
本书不仅可供食品酶学等领域科研人员与相关专业师生参考，同样也适合果酒发酵从业者阅读。

近年来，随着现代生物技术的不断进步，尤其是生物信息学、分子生物学突飞猛进的发展，为人们深入认识酶的结构功能和催化机理提供了更多可能。
作为一种纤维素酶，β-葡萄糖苷酶广泛应用于生物质能源转化、食品和医疗等领域。在β-葡萄糖苷酶的众多来源中，微生物来源的β-葡萄糖苷酶具有产量高、价格低廉、催化效率高等优点，一直受到广大科研人员的关注。目前，研究人员已对微生物来源的β-葡萄糖苷酶作了大量研究，但这些研究主要关注于黑曲霉和酵母菌来源的β-葡萄糖苷酶，而对于乳酸菌（酒酒球菌）来源的β-葡萄糖苷酶的研究较少，关于其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理也缺乏必要的阐释。
酒酒球菌（Oenococcus oeni ）是葡萄酒发酵过程中应用最多的一类乳酸菌，除了可以降低酒的酸度外，其所产的β-葡萄糖苷酶还可以将葡萄酒中糖苷键合态的香气化合物转化为游离态的香气物质，从而显著提升葡萄酒的香气水平。
为深入了解和阐释β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理，本书对酒酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶进行了系统研究与概述。首先是酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源进化分析，这对于酶的功能预测及新型β-葡萄糖苷酶资源的开发具有指导意义；其次，通过基因克隆和异源表达技术分离得到了来自酒酒球菌SD-2a 的重组β-葡萄糖苷酶BGL0224，研究该重组酶的酶学性质、结构和催化机理，不仅可以加深对β-葡萄糖苷酶乃至糖苷水解酶家族的认识，也可以为提高β-葡萄糖苷酶的催化效率提供理论依据；此外，以商业β-葡萄糖苷酶作为对比，分析重组β-葡萄糖苷酶BGL0224 对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响，拓宽了该重组酶在食品发酵工业的应用前景，对于提升我国果酒的品质具有重要意义。
为使读者获得更好的阅读体验，本书中的一些彩图以及书中提及的一些生物信息学分析工具，将以电子文档形式提供，读者可扫描下方二维码查阅。
编写分工方面，本书第1 章由李鹏燕编写，第2 ～7 章由张杰编写。在本书的编写过程中，西北农林科技大学樊明涛教授、河南科技大学古绍彬教授为我们提出了很多宝贵意见，在此表示感谢。
食品酶学领域科学技术发展迅速，新技术、新方法层出不穷，知识体系不断丰富更新。笔者的认识难免存在局限性，书中的疏漏和不当之处恳请读者批评指正。

编著者
2024年2月

第1章 绪论 1 
1.1 β-葡萄糖苷酶简介 1
1.1.1 β-葡萄糖苷酶的分类  1
1.1.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 2
1.1.3 β-葡萄糖苷酶酶活性的测定方法 3
1.1.4 β-葡萄糖苷酶的结构与功能 4
1.1.5 β-葡萄糖苷酶的一般催化机制 6
1.2 不同来源的β-葡萄糖苷酶研究进展 8
1.2.1 动物来源的β-葡萄糖苷酶 8
1.2.2 植物来源的β-葡萄糖苷酶 9
1.2.3 微生物来源的β-葡萄糖苷酶 11
1.3 β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用 14
1.3.1 茶叶增香 16 
1.3.2 果汁增香 17 
1.3.3 葡萄酒增香 18 

第2章　酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源分析 20
2.1 基因的同源分析 20 
2.1.1 序列获取 20 
2.1.2 理化性质分析 21 
2.1.3 保守结构域和Motif分析 21
2.1.4 进化树构建 21 
2.2 同源分析结果 22 
2.2.1 理化性质分析结果 22 
2.2.2 保守结构域和Motif分析结果 23
2.2.3 同源关系分析结果 26 
2.3 讨论 27 
2.4 本章小结 28 

第3章　酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的异源表达和纯化 29
3.1 酶的异源表达和纯化 30 
3.1.1 试验材料与仪器 30 
3.1.2 主要仪器 30 
3.1.3 表达载体的构建 31 
3.1.4 表达目的蛋白 37 
3.1.5 分离纯化目的蛋白 38 
3.1.6 酶活性测定 39 
3.2 酶的异源表达与分离纯化结果分析 40 
3.2.1 基因组DNA的提取 40
3.2.2 目的基因的克隆表达 41 
3.2.3 重组酶BGL0224的分离纯化 44
3.3 讨论 46 
3.4 本章小结 49 

第4章　重组β-葡萄糖苷酶BGL0224的酶学性质表征 51
4.1 重组酶BGL0224的酶学性质表征 52
4.1.1 试验材料与试剂 52 
4.1.2　主要仪器 52 
4.1.3 生物信息学分析 52 
4.1.4 最适反应温度及热稳定性测定 53 
4.1.5 最适反应pH及pH稳定性测定 53
4.1.6 最适乙醇浓度及乙醇耐受性测定 54 
4.1.7 不同添加物对BGL0224酶活性的影响 54
4.1.8 结构检测 55 
4.1.9 酶促反应动力学常数测定 56 
4.2 酶学性质的表征结果与分析 57 
4.2.1 BGL0224的生物信息学分析 57
4.2.2 BGL0224的基本理化性质 60
4.2.3 BGL0224的结构初步表征 63
4.2.4 BGL0224的酶促反应动力学参数 65
4.3 讨论 67 
4.4 本章小结 70 

第5章　重组β-葡萄糖苷酶BGL0224的催化机理探究 72
5.1 重组酶BGL0224的催化机理研究 73
5.1.1 试验材料与试剂 73 
5.1.2 主要仪器 74 
5.1.3 最适温度、最适pH测定 75
5.1.4 酶促反应动力学参数及活化能Ea测定 75
5.1.5 底物对重组酶的猝灭机制和结合能力检测 75 
5.1.6 构建BGL0224的三维结构模型 75
5.1.7 BGL0224与底物的分子对接 76
5.1.8 BGL0224与底物的分子动力学模拟 76
5.2 催化机理研究的结果与分析 77 
5.2.1 温度和pH对BGL0224催化底物的影响 77
5.2.2 BGL0224催化底物的动力学参数和活化能 78
5.2.3 不同底物对BGL0224的猝灭机制和结合能力 82
5.2.4 BGL0224催化底物p-NPG的分子模拟 85 
5.3 讨论 93 
5.4 本章小结 95 

第6章 重组β-葡萄糖苷酶BGL0224对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响 97 
6.1 探究β-葡萄糖苷酶对葡萄酒品质的影响 98
6.1.1 试验材料与试剂 98 
6.1.2 主要仪器 98 
6.1.3 葡萄酒酿造工艺与实验设计 99 
6.1.4 电子鼻测定方法 100 
6.1.5 气相色谱质谱联用仪（GC-MS）测定方法 100 
6.1.6 香气感官评价 101 
6.2 结果与分析 101 
6.2.1 电子鼻分析 101 
6.2.2 GC-MS分析 105
6.2.3 感官评价分析 112 
6.3 讨论 114 
6.4 本章小结 117 

第7章　β-葡萄糖苷酶研究展望 118

参考文献 120 

附录 135